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PhyNexus 蛋白質(zhì)A PhyTip列 說明書

更新時(shí)間:2019-12-06      點(diǎn)擊次數(shù):4045

PhyNexus在一直是行業(yè)的*,一直為廣大科研客戶提供zui為的產(chǎn)品和服務(wù),上海起發(fā)一直秉承為中國(guó)科研客戶帶來的產(chǎn)品,的服務(wù),為了給廣大科研客戶帶來更加完善的產(chǎn)品和服務(wù),您的滿意將是我們zui大的收獲

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Douglas Gjerde于2002年在加利福尼亞州的圣何塞市建立了PhyNexus公司,以調(diào)查蛋白質(zhì)樣品制備的需求。專欄和機(jī)器人被開發(fā)小型化和自動(dòng)化過程,當(dāng)保留蛋白質(zhì)的自然狀態(tài)時(shí)。2005年,引進(jìn)了一整列的專欄和機(jī)器人。在接下來的幾年中,柱子被修改為與所有主要的機(jī)器人液體處理器兼容。定期提供超過20種色譜柱的化學(xué)品,提供超過100種定制包裝的產(chǎn)品。從2016年開始,引入了試劑盒和儀器,大大增加了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的可用性。PhyNexus客戶是制藥公司和學(xué)術(shù)界的生命科學(xué)家。

 

PhyNexus開發(fā)了一種*的微型工程蛋白質(zhì)和抗體純化技術(shù),使研究人員能夠定期純化和富集樣品量達(dá)1 mL。PhyTip™色譜柱的*設(shè)計(jì)允許低至10μL的洗脫體積,從而產(chǎn)生高達(dá)50倍的富集因子,純化蛋白濃度可達(dá)5 mg / ml。

純化和富集過程是一個(gè)簡(jiǎn)單的三步技術(shù),首先捕獲感興趣的蛋白質(zhì),然后純化并zui終富集。整個(gè)過程可能需要不到15分鐘,以產(chǎn)生高濃度的全功能蛋白質(zhì),以備進(jìn)一步分析。

蛋白A PhyTip柱顯示功能性抗體(IgG)的高結(jié)合親和力和高容量親和力純化。

  • 70-90%的IgG回收率
  • 獲得高度濃縮的純化蛋白質(zhì)
  • 顯示蛋白A PhyTip柱可以從不同水平的背景蛋白中提取非常高純度的IgG蛋白

 

PhyNexus PhyTip蛋白質(zhì)A

 

 

 

 

 

 

 

蛋白質(zhì)A PhyTip列

具有蛋白A的PhyTip色譜柱已針對(duì)特定的PhyNexus試劑和儀器流速/體積進(jìn)行了優(yōu)化,如下所示。這些信息是使用PhyNexus純化系統(tǒng)收集的。所有含蛋白A的PhyTip色譜柱均配有推薦的PhyTip緩沖液,包括:捕獲緩沖液 - 適用于需要添加額外緩沖液以補(bǔ)充樣品體積并確保捕獲正確pH的情況。清洗緩沖液I - 磷酸鹽緩沖液pH 7.4清洗緩沖液II - 鹽水溶液。注意:無緩沖能力以確保有效洗脫富集緩沖液 - 用于zui終洗脫步驟 - 磷酸鹽緩沖液pH 2.5中和緩沖液。 - Tris緩沖液pH9.0注意:濃縮緩沖液以4mL的pH2.5磷酸鹽緩沖液提供,

含蛋白A樹脂的200多個(gè)PhyTip色譜柱:

對(duì)于含有1mg BSA的5μgIgG2a(抗FITC MAb。)的200μL樣品,使用下述條件進(jìn)行處理,在zui終樣品體積中回收大于40%的原始IgG質(zhì)量。另外,通過用考馬斯(Coomassie)檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定,回收的IgG超過95%純。

捕獲:通過以250μL/分鐘的流速通過樹脂床4個(gè)循環(huán)捕獲200μL樣品。

純化:將200μL的PhyNexus蛋白A洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個(gè)循環(huán),接著用洗滌緩沖液II再次洗滌,在樹脂床上流過兩個(gè)循環(huán)速率500μL/ min。

富集:用10μLPhyNexus A蛋白富集緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫至溶液中,以500μL/ min的流速通過樹脂床5個(gè)循環(huán)。用3μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

所運(yùn)送的蛋白G富集緩沖液包含:111mM NaH 2 PO 4,14.8mM H 3 PO 4中的140mM NaCl,pH 3.0

含蛋白A樹脂的1000+ PhyTip色譜柱:

對(duì)于含有5mg BSA的10μgIgG2a(抗-FITC MAb。)的500μL樣品,使用下述條件進(jìn)行處理,在zui終樣品體積中回收大于40%的原始IgG質(zhì)量。另外,通過用考馬斯(Coomassie)檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定,回收的IgG超過95%純。

捕獲:以250μL/分鐘的流速通過樹脂床捕獲500μL樣品四個(gè)循環(huán)。

純化:將1000μL的PhyNexus蛋白G洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個(gè)循環(huán),接著用洗滌緩沖液II再次洗滌,以流速500通過樹脂床兩個(gè)循環(huán)μL/分鐘。

富集:用15mL PhyNexus蛋白A富集緩沖液將蛋白洗脫到溶液中,以500μL/ min的流速通過樹脂床5個(gè)循環(huán)。用5μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

 

蛋白APhyTip®色譜柱的性能特征和分析步驟

介紹

PhyNexusPhyTip®色譜柱是創(chuàng)新性的純化工具,從根本上簡(jiǎn)化了各種來源的蛋白質(zhì)的捕獲,純化和富集。這些凈化工具成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)保留親和樹脂床的機(jī)制,具有zui小的死體積和zui大的捕獲潛能。一組PhyTipcolumn結(jié)合蛋白A在特定的*條件下特異性結(jié)合來自不同來源的抗體(IgG),因此可以去除核酸和其他污染物。快速洗滌步驟后,純化的抗體很容易用常用的低pH緩沖液洗脫。該技術(shù)允許特異性的高產(chǎn)量的IgG,取決于各種條件,并且提供在非常高濃度的載體蛋白如BSA存在下的高度選擇性純化。PhyTip色譜柱具有*的結(jié)合能力,可以結(jié)合大于100μg的IgG,并且可以有效地回收少至200 ng的IgG - 代表幾乎三個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍。PhyTip色譜柱非常適合從雜交瘤上清液進(jìn)行抗體篩選,或用于高通量提取和純化親和標(biāo)記蛋白質(zhì)。

績(jī)效和分析程序

IgG以高親和力和特異性結(jié)合蛋白A. 這種相互作用的強(qiáng)度和選擇性使蛋白質(zhì)A能夠有效地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中純化出IgG。為了檢查用蛋白A樹脂的PhyTip柱的性能,測(cè)量了使用1000個(gè)蛋白A PhyTip柱的純化IgG(抗FITC-MAb)的回收百分比。

材料和方法

樣品:在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中的10μgmFITC-MAb(IgG2a亞類)或
2.含有10%FBS(胎牛血清)的DMEM或
3.含有5mg BSA的SFM(無血清培養(yǎng)基)
樣品處理:使用以下方案在半自動(dòng)ME 1000平臺(tái)上處理所有樣品:

  1. (1)捕獲:通過使樣品在樹脂床上以2個(gè)輸入/輸出循環(huán)(以0.6ml @ 0.25ml / min的體積設(shè)定)捕獲特定蛋白質(zhì)。
  2. (2)純化:通過用0.5mL PBS(洗滌緩沖液I)洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)/親和樹脂,使用1進(jìn)/出循環(huán)(體積設(shè)定為0.6ml,0.5ml / min)除去未結(jié)合的蛋白質(zhì),隨后是1進(jìn)/出循環(huán)(體積程序?yàn)?.6ml,0.5ml / min)和0.5ml鹽水溶液(洗滌緩沖液II)。
  3. (3)富集:用15μLpH 3.0洗脫緩沖液以4次輸入/輸出循環(huán)洗脫IgG2a(體積程序?yàn)?.1-0.15ml @ 1ml / min)。一旦洗脫,加入5μL中和緩沖液。請(qǐng)注意,PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip色譜柱的當(dāng)前洗脫緩沖液的pH值為2.5,目前的中和緩沖液的pH值為9.0。

定量程序

(1)為了制備還原的IgG2a,將15μlzui終洗脫體積與5μl新鮮制備的TCEP(15μl10mg / ml TCEP的水溶液,終體積30μl)反應(yīng)。

(2)使用HP 1050HPLC系統(tǒng)將20μl還原的IgG2a注射到無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相(C-18)柱中。溶劑A(0.1%TFA的水溶液)和溶劑B(0.1%TFA的ACN溶液)之間的梯度為25%至75%,使用5分鐘。檢測(cè):在214和280nm處的UV。

  1. (3)大約3.18和3.34分鐘時(shí)洗脫主要的IgG2a峰。在這兩個(gè)峰下面的區(qū)域在每種情況下從(3.13-3.5)分鐘積分,相應(yīng)的峰面積在214nm處記錄。
  2. (4)在相同的反應(yīng)條件下將TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)物加載到柱子中并用作回收計(jì)算的輸入或標(biāo)準(zhǔn)。

IgG2a恢復(fù)的結(jié)果

在DMEM + 10%FBS中的回收率=在SFM + 5mg BSA中的77%回收率= 64%。

已知載體蛋白如白蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并有助于產(chǎn)生良好的抗體,所以當(dāng)抗體產(chǎn)生時(shí)其通常以高量存在。因此,任何純化和富集程序必須能夠耐受高濃度的白蛋白。另外,上面顯示的結(jié)果似乎表明高背景蛋白質(zhì)濃度(例如BSA)的存在可能對(duì)回收率具有有益的影響。

載體蛋白存在下IgG2a回收率的重現(xiàn)性

為了驗(yàn)證載體蛋白在zui大IgG2a回收率中的作用,并證實(shí)重現(xiàn)性,從多個(gè)樣品(n = 4)中從PBS(以及含有5mg BSA的PBS)純化IgG2a。結(jié)果表明在存在500倍過量的BSA濃度的情況下提高了純化的IgG2a的恢復(fù)(至少20%或更多),并且該程序也是高度可重現(xiàn)的。

在PBS中回收= 42.25%(SD = 4.66%)在PBS中回收+ 5mg BSA = 66.5%(SD = 7.5%)

選擇性性能和分析程序

為了表征和驗(yàn)證蛋白A-IgG親和相互作用的選擇性,將5mg BSA作為載體蛋白加入到0.5ml樣品體積(333倍過量)中的15μgIgG中。使用蛋白A PhyTip柱處理樣品。

材料和方法

樣品:在含有5mg BSA(10mg / ml或1%w / v BSA)的0.5ml PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb(IgG2a亞類)。樣品處理:如上所述的恢復(fù)性能和分析程序。

IgG定量和純度分析程序:

(1)將15μlzui終洗脫體積分成兩部分:13μl與新制備的13μl10mg / ml TCEP(終體積=26μl,[TCEP] = 17.5mM)在室溫下反應(yīng)約16小時(shí),同時(shí)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中將2μl加載到凝膠上。

(2)使用HP 1050HPLC系統(tǒng),將26μl以上的減少的IgG2a中的20μl注入到無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相(C-18)柱中。溶劑A(0.1%TFA的水溶液)和溶劑B(0.1%TFA的ACN溶液)之間的梯度為25%至75%,使用5分鐘。檢測(cè):在214和280nm處的UV。

  1. (3)在3.17和3.3分鐘左右洗脫兩個(gè)主要的IgG2a峰。這兩個(gè)峰下的面積在每種情況下從(3.13-3.5)分鐘積分,相應(yīng)的mAU在214nm記錄。
  2. (4)在相同的反應(yīng)條件下,將TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)物(注入量為1.08,2.16,4.32,6.48和8.64μg的FI TC-M Ab)加載到柱中并用作恢復(fù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

PhyNexus建議使用含有IgG的PhyTip入門試劑盒作為標(biāo)準(zhǔn)來驗(yàn)證PhyTip色譜柱在所有應(yīng)用中的使用。

純化和富集的樣品必須清晰,無顆粒物質(zhì)。強(qiáng)烈建議離心樣品,并使用PhyTip色譜柱前僅使用清澈的上清液。

運(yùn)輸和存儲(chǔ)

每包PhyTip色譜柱已經(jīng)制造并按照zui高標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了質(zhì)量控制,并運(yùn)送到保持盒中,以保持每個(gè)PhyTip色譜柱內(nèi)特定親和樹脂的完整性。本產(chǎn)品在環(huán)境溫度下運(yùn)輸,但收到時(shí)應(yīng)存放在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室冰箱中,溫度在4℃到8℃之間。

  • 不要凍結(jié)或凍結(jié)。
  • 不使用時(shí),請(qǐng)將箱子的蓋子關(guān)好并密封好,存放在冰箱內(nèi)。
  • 不要讓親和樹脂在干燥的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存放干燥。

當(dāng)從PhyNexus運(yùn)輸時(shí),含有蛋白A的PhyTip色譜柱儲(chǔ)存在甘油中。

 

相關(guān)產(chǎn)品如下:

 

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