Abwiz Bio，我們開發并優化了一個三階段抗體親和力成熟平臺，該平臺涉及三個獨立的文庫構建和選擇/篩選步驟。在每個篩選步驟之后，將工程克隆整合在一起，用于隨后的文庫構建。在階段1中使用六個單獨的CDR靶向文庫可以使我們探索大的序列空間。在每個階段對工程克隆的篩選和測序，使我們能夠監控進度，并提供有用的信息，有助于后續的文庫設計。

由于每種抗體的起始親和力和序列以及抗原的性質對于每個項目都不同，因此很難預先預測親和力成熟的一階段是否令人滿意，或者是否需要親和力成熟的第二和第三階段。因此，在每個階段的后，我們將介紹已完成的工作并與每個客戶進行公開討論，以確保他們滿意并確定項目的后續步驟。

 STEAM（增強階段親和力成熟度）技術

abwizbio新穎的三階段工程平臺

我們的團隊在設計用于基于噬菌體的選擇的合成文庫方面擁有數十年的集體經驗。Abwiz Bio領導了多次成功的親和力成熟活動，為具有低納摩爾起始親和力的人，小鼠和兔抗體產生了> 10倍的親和力改善。我們已經開發并驗證了一種穩健的親和力成熟方案，該方案始于分別針對六個CDR進行誘變。我們的多階段方法涵蓋了更多的多樣性，并產生了更高的親和力克隆，而這是傳統的方法（如CDR步移）無法實現的。

階段1	第二階段	第三階段
6個CDR靶向庫	L1 + L2 + L3和H1 + H2 + H3合并在單獨的庫中	組合式H + L
通過構建針對每個CDR的獨立文庫，我們對大序列空間進行了采樣	預先選擇的CDR庫合并在一起以創建單獨的LC / HC庫	終的文庫對預先選擇了重庫和輕庫，以獲得高的親和力克隆

依靠經驗豐富的團隊來設計您的圖書館

抗體的互補決定區（CDR）與抗原形成大部分結合表面。CDR包含三個環，分別從每個抗體臂可變區內的重鏈（CDR H1，H2和H3）和輕鏈（CDR L1，L2和L3）延伸。可以通過針對這些區域進行誘變來改善親和力。但是，噬菌體展示的生物學限制（大大腸桿菌的限制轉換效率）將給定庫中可能的變體總數限制為?1E + 10。（與酵母展示相比，庫的大小要大得多，大?1E + 08）。對所有可能的變體隨機分配一個6個氨基酸的片段，可產生1.07E + 09的理論多樣性；因此，理論多樣性可以成倍地超過實際圖書館的多樣性。通過靶向單獨文庫中的每個CDR，可以針對階段1中的每個單獨環優化抗原相互作用。

對于每個CDR，使用生物信息學方法選擇假定對于抗原結合而言不是理想的氨基酸。通過將您的序列與抗體種系和結構數據庫進行比較，我們可以推斷出哪些位置可能已經針對抗原結合進行了優化，哪些可以耐受突變。我們過去在成功開展人類和小鼠治療候選藥物方面的經驗，也為我們的選擇提供了依據。我們將總文庫大小限制在理論多樣性極限內，同時避免了會破壞全局抗體穩定性的突變和程度地采樣序列圖。

抗原結合克隆的CDR H1和H2序列以序列徽標格式顯示。值得注意的是，（1）僅在設計用于誘變的每個位置上發現了氨基酸；（2）與階段1相比，階段2克隆具有更強的序列收斂性；（3）在親和力成熟的庫中存在高度多樣性。

基于噬菌體的選擇的好處

噬菌體選擇非常靈活，可以調整以獲得所需的抗原特異性或親和力參數。選項包括（1）與陰性對照抗原競爭對交叉反應性結合劑的陰性選擇；（2）通過以較低濃度包被抗原和/或通過改變孵育和洗滌時間進行嚴格選擇，以進行基于速率的動力學選擇，（3）抗原構象特異性選擇與重組和基于細胞的抗原都兼容，后（4）噬菌體病毒在80°C穩定，可以選擇熱穩定的高表達克隆。

我們專有的載體與Fab噬菌體和可溶性Fab生產均兼容，可在噬菌體淘選后進行快速篩選。選擇后，產生數百個隨機挑選的克隆，并從細菌上清液中篩選為可溶性Fab。在進入昂貴，費時的IgG生產階段之前，篩選高通量的潛在候選基因可以節省大量時間和資源。除了全序列分析外，還可以通過ELISA，流式細胞儀，功能分析和SPR高通量篩選針對重組蛋白或基于細胞的蛋白的Fab 。

我們的協議已經過嚴格驗證

我們的三階段工程策略被用于提高與識別潛在癌癥靶標的候選抗體候選物的親和力。在每個階段鑒定的工程克隆的測序分析為我們的3階段策略提供了有力的支持。

篩選過程中鑒定出的*CDR數如下所示。（CDR數）/（CDR總數）顯示每個篩選階段每個CDR的所選克隆的序列多樣性。

在先前的選擇回合中識別出的CDR的數量如下所示。這顯示了具有先前在階段1（或階段1和2）中鑒定的CDR序列的克隆數。

在每個階段的篩選步驟中均一致鑒定出*的CDR序列。傳統的CDR步移協議 （在繼續設計下一個CDR之前，從單個文庫中選擇宜CDR克隆），而不是使用我們的方法來組合整個預選CDR庫以進行其他文庫選擇，將無法確定宜方法。候選人。這些數據為我們的三階段工程策略提供了有力的支持。

展示成功

申請治療

在一個客戶項目中，我們成功地將親和力提高了10倍，與pM K D的結合力提高了，同時又增加了候選治療藥物的功能。使用了兩階段方法（單個CDR→組合的H + L文庫），并且在進一步的臨床研究之前就宜工程克隆的序列。

與親本野生型相比，工程化Fab的解離速率更慢，這表明通過SPR分析提高了親和力。

提供給客戶數十名工程候選人

在另一個客戶項目中，我們通過詳盡的3階段方法（單個CDR→單獨的H + L→組合的H + L庫）將親和力提高了10-100倍。我們向客戶提供了23個經過工程設計的候選物用于IgG功能篩選，每個候選物具有*的序列并大大提高了親和力。

上面顯示了在每個工程階段之后進行的Fab篩選的克隆。第1階段克隆顯示出比野生型更高的親和力，但仍保留更快的解離速率。從第2階段庫獲得較低的失效率。只有在第3階段工程后才能獲得具有飽和結合和非常慢的脫模速率的克隆。

我們靈活的平臺可滿足您的需求

僅在第1階段工程（單個CDR庫）或第2階段（僅重鏈或輕鏈庫）后，才能確定親和力的充分提高。在一個項目中，我們的客戶對第2階段后的結果感到滿意。我們的靈活平臺包括每個工程階段之后的Fab特性鑒定，從而使我們的客戶可以通過在多個點評估項目成果來節省時間和資源。這使我們能夠快速提供結果，并根據需要調整我們的工程方法。

測試了階段2克隆針對親本野生型Fab和非速率ELISA中宜階段1工程改造的克隆。選自第2階段文庫的突變可顯著改善親和力。

項目時間表

我們開始設計您的文庫所需要的只是抗體的氨基酸序列。一步，合成用于文庫構建的抗體基因和寡核苷酸，通常在基因合成后約2個月完成階段1工程。第2階段和第3階段分別可以在4-6周內完成，因為它們可以立即進行庫合成步驟。因為每個項目都是*的，所以我們在每個階段的開始都與每個客戶緊密合作，以仔細審查先前的篩選數據并制定可靠的計劃。